00:00:00
e começa a gló tinha uma técnica
00:00:03
Laboratorial de biologia molecular que
00:00:05
identifica proteínas específicas de uma
00:00:07
determinada amostra a partir da
00:00:10
separação e essas proteínas de um George
00:00:11
poliacrilamida e ela composto então de
00:00:15
acrilamida e da bisacrilamida essa
00:00:17
combinação vai formar uma rede belmond
00:00:23
é ou não pode isso que a gente conversa
00:00:25
tem nas passem por ela a partir do
00:00:28
processo de eletroforese que teria uma
00:00:31
corrente elétrica queria bocado para o
00:00:34
Ano ou seja negativo para o positivo
00:00:38
para que essa separação aconteça Então
00:00:41
as proteínas devem se encontrar na sua
00:00:43
estrutura primária então de pé
00:00:46
a estratégia Para que ocorra de
00:00:49
maturação essas proteínas um exemplo
00:00:52
disso é a presença de sdf que é um
00:00:55
detergente no tampão
00:00:57
e por isso parte dessa técnica não seja
00:01:00
quando estamos correndo de também
00:01:03
conhecido como SSP SDS do detergente que
00:01:07
vai no tampão para provocado na
00:01:11
o primário eo page que seria de Polly
00:01:14
tira olha aqui pela amiga então pelo
00:01:17
fato das proteínas serem compostas por
00:01:19
cadeias polipeptídicos de diferença
00:01:21
aminoácidos ligados entre si elas
00:01:24
possuem diferença estruturas que isso
00:01:26
também confere a elas diferentes pesos
00:01:28
moleculares por isso essa técnica é
00:01:31
capaz de identificar diferentes tipos de
00:01:33
proteínas de acordo com seu peso
00:01:35
molecular porque nesse Giorgio Colli
00:01:37
clima poliacrilamida Elas serão
00:01:39
separadas pelo seu peso para nós fazemos
00:01:42
Matriz note então nós vamos precisar de
00:01:45
um gel 1
00:01:47
bom então vocês podem perceber
00:01:52
o que não devem chegar logo que o que
00:01:55
ele é um gel como se fosse de cabelo
00:01:57
mesmo E aqui nessa parte de cima nós
00:01:59
temos esse peitinho quando eu tirar esse
00:02:01
pontinho aqui onde tem o plástico
00:02:04
perguntar o Buraquinhos Esse é o local
00:02:07
onde eu vou aplicar as meninas amostra
00:02:11
e Como disse anteriormente essa mostra
00:02:15
Então essas proteínas elas se separam a
00:02:17
partir de uma corrente elétrica que vai
00:02:19
passar por região Então como que eu vou
00:02:22
posicionar esse gel que ele passa uma
00:02:24
corrente elétrica mesmo aí gente precisa
00:02:26
uma parada então nosso aparato de Então
00:02:30
tá vendo ele tem uma parte aqui é o
00:02:32
preto EA preta e essa parte aqui
00:02:34
vermelho tá ele aqui eu vou conectar a
00:02:37
uma fonte de energia o que que acontece
00:02:39
a corrente elétrica ela vai passar da
00:02:42
parte negativa da parte positiva isso
00:02:45
que vai fazer com que a proteína mesmo
00:02:47
se separem Portuguesa e onde eu vou
00:02:51
posicionar este aparato para que as
00:02:54
proteínas para que passa essa energia
00:02:56
não pode ficar sim simplesmente não
00:02:58
precisamos colocar o líquido e mais pro
00:03:00
nosso tampa e olha eu vou colocar isso
00:03:03
e fica parado vai onde
00:03:07
e amigos não
00:03:12
bom Então essa é a nossa Cuba do Éster
00:03:16
Button nós vamos simplesmente encaixar o
00:03:19
nosso gel aqui colocar aqui dentro
00:03:21
colocar no tampão de corrida e
00:03:23
aplicarmos as amostras naquele potinho
00:03:25
que eu falei para você eu vou mandar
00:03:28
aqui ó
00:03:39
bom então coloco aqui é o aparato
00:03:43
Fashion tenho que ir agir e também não
00:03:48
massinha preta aqui então a parte preta
00:03:50
também vai ficar onde está massinha
00:03:52
preta que depois vai corretivo tive
00:03:57
sempre vai passar desse lado para esse
00:03:58
Quando eu colocar o tempo lembra que o
00:04:00
disco tem colocar um tampão Então eu só
00:04:02
de corrida de conhecer coloca aqui ó
00:04:09
E aí
00:04:13
E aí
00:04:18
e pronto meu coração está pronto para
00:04:22
que o aplica nas amostras aqui eu só
00:04:24
preciso tirar aqueles pintinhos e eu
00:04:28
tava o gel para faça os buraquinhos para
00:04:30
eu colocar as mãos
00:04:33
E aí
00:04:37
é aquela seja aqui só tem proteja e eu
00:04:41
coloquei um corrente esse corante azul e
00:04:44
ele serve para que nós simplesmente
00:04:46
conseguiu para nós conseguimos enxergar
00:04:48
as amostras como quando nós colocarmos
00:04:51
ela não senão a gente não vai garantir
00:04:52
se viver tô rodelas escolhi todo o link
00:04:56
do não uma vez o extrato de proteína ele
00:04:58
é transparente e
00:05:01
nós fizemos aqui em cima aqui no
00:05:04
protocolo do meu laboratório nós
00:05:06
aquecermos essas amostras a 90
00:05:10
bom então aqui separado ele já tá aqui
00:05:14
tem 95 graus eu vou colocar as minhas
00:05:16
amostras aqui
00:05:21
ó e vou esperar cinco minutos até ela
00:05:25
aquecer a
00:05:28
o último eu coloco uma substância
00:05:42
chamada entendeu um rapaz
00:05:45
E aí
00:05:51
E aí
00:05:55
e terciária
00:06:03
E aí
00:06:09
E aí
00:06:11
o valor
00:06:12
o Face da sua família
00:06:15
Bom dia
00:06:24
eu não sei se vocês conseguem enxergar
00:06:27
ter que nos pequenos Marquinhos aqui ó
00:06:31
Focinhos como eu colocar a moto a gente
00:06:33
vai conseguir enxergar melhor
00:06:38
a hora para ver se eu vendo os
00:06:41
buraquinhos Então agora que as minhas dá
00:06:44
uma sugestão aquecidas eu vou aplicar lá
00:06:46
aqui no Gel 1
00:06:48
bom então eu vou visitar uma quantidade
00:06:52
fixa para todas as amostras aqui no caso
00:06:54
de 14 micro litros
00:07:06
Oi e eu sempre vou trocar a ponteira
00:07:08
Quando eu for para o petar é outra
00:07:12
mostra para que eu não conta minha
00:07:15
aquela mostra certo senão extrato de um
00:07:17
de uma mostra está na outra já dá para
00:07:26
vocês verem as amostras aqui nos
00:07:28
próximos né agora que eu já apliquei
00:07:35
aqui betei todas as minhas amostras no
00:07:37
gel que eu preciso fazer como que eu vou
00:07:40
saber qual o peso é copo com as
00:07:43
proteínas aqui como que eu vou adivinhar
00:07:45
então nós precisamos de um autômato
00:07:48
chamamos de marcador marcador você que
00:07:52
esse líquido eu vou aproveitar não
00:07:53
consigo aqui do meu geral e ele vai
00:07:56
correr junto com as proteínas Só que já
00:07:58
são pré-determinados eu vou explicar
00:07:59
para vocês uma qualquer mais pra frente
00:08:02
Como funciona o marcador e ele vai se
00:08:03
preparar em coisas e
00:08:05
e não ficar aqui começa agora eu peço
00:08:08
uma quantidade menor que ele ele tem
00:08:11
eficiente e
00:08:15
E aí
00:08:18
Hoje eu tô aqui então
00:08:22
e o marcador do lado das minhas amigas
00:08:32
bom e coloca uma j-coin como que eu
00:08:35
coloco meu gel para correndo mostrar
00:08:36
para você então coloco a minha Cuba
00:08:41
o que coloca a tampa na minha culpa
00:08:46
então eu tenho que garantir que eu
00:08:48
coloquei o preto no preto e vermelho no
00:08:50
vermelho essa Cuba não permite que eu
00:08:52
coloquei errado tá porque senão não
00:08:54
encaixa é por causa desse Pinho aqui
00:08:56
então encaixei vem aqui se prepara eu
00:08:59
vou deixar correr ainda 40 Volts no
00:09:01
começo e eu ir aos poucos eu vou
00:09:04
aumentando
00:09:05
Ah tá então já está correndo aqui vamos
00:09:09
sair aqui é bem não é tão nítida Porque
00:09:12
você tá com vontade muito baixa mas você
00:09:14
ainda umas bolinhas que a corrente de ar
00:09:16
passando um
00:09:18
bom então sobre o marcador existem
00:09:21
diferentes marcas modelos
00:09:23
é basicamente marcador então proteína já
00:09:27
comprei esse conhecidos então cada uma
00:09:29
das elas vão ter uma cor
00:09:32
e e e elas vão se separar e aquela coisa
00:09:36
representar determinado peso então
00:09:38
quando você como marcador é ele já vem
00:09:41
com a legenda dele né que é diz a tal
00:09:45
cor é 80 km de altura a outra cor
00:09:49
embaixo essa receita que Ronald disse
00:09:51
assim por diante e uma coisa que é
00:09:53
importante e interessante ressaltar é
00:09:56
que proteínas elas se separam no gel de
00:09:59
forma inversamente
00:10:02
o quanto mais pesada mais próxima zocal
00:10:06
quanto mais leve mais para baixo no
00:10:08
carro ou seja as pesadas não descem como
00:10:11
a gente imagina que acontece nas
00:10:13
soluções com solutos curto ou né elas
00:10:16
ficam as pesadas ficam em cima elas se
00:10:18
prendem em cima naquela rede de
00:10:20
poliacrilamida enquanto as mais leves
00:10:22
elas conseguem passar pelos poros eu não
00:10:25
fico mais na parte de impacto gel então
00:10:28
quando nós podemos uma membrana que com
00:10:31
as proteínas dela Presidente as
00:10:33
proteínas que estão mais acima da
00:10:35
membrana que não proteinas mais pesadas
00:10:37
que as proteínas que estão mais abaixo
00:10:38
tá lembrando essas proteínas mais leves
00:10:40
então passado algumas horas ou meu Jão
00:10:43
correu aqui e se vocês estarem bastante
00:10:47
atenção é possível ver algumas
00:10:49
marquinhas uma azul e uma vermelha e
00:10:52
isso aqui é o marcador se separou tá
00:10:55
então ainda era para ter mais correram e
00:10:58
elas estão em diversas alturas
00:10:59
diferentes por exemplo essa marquinha
00:11:01
ver
00:11:02
Oi aqui é a marca desse marcador dessa
00:11:05
marca que eu utilizo ela é autora de 80
00:11:08
kilodaltons em todas as proteínas que
00:11:11
tem 80 que eu dar os muito mais ou menos
00:11:13
nessa linha só que eu não posso usar o
00:11:15
gel dessa forma então vou fazer o
00:11:17
processo de transferência e
00:11:22
o que fazer
00:11:25
G1
00:11:29
o separados pelo seu peso molecular
00:11:32
Store
00:11:34
e ela
00:11:40
e para transferência nós fazemos um
00:11:43
sanduíche nesse aparato preto e vermelho
00:11:45
com uma esponjinha e um papel filtro em
00:11:50
seguida Nós pegamos o gel
00:11:54
Oh e vamos retirar o vidro de cima desse
00:11:56
gel e tirar a parte onde optamos as
00:11:59
amostras
00:12:00
e para ficar com a parte que apenas tem
00:12:02
as proteínas que correram nesse gel tão
00:12:06
aqui se Vocês conseguem enxergar o
00:12:08
marcador colocar esse papel filtro atrás
00:12:10
que ficar melhor e aqui Vocês conseguem
00:12:13
enxergar alguns marcadores da corrida do
00:12:15
gel que se separaram eu vou passar o gel
00:12:19
para o meu papel filtro
00:12:22
e com cuidado para não quebrar o gel
00:12:24
porque ele é bem sensível bem fininho
00:12:27
pronto aí eu tiro as bolhas de ar que
00:12:31
ficam entre o papel filtro e o gel
00:12:36
e para garantir que é corrente passe de
00:12:38
forma uniforme A corrente elétrica passa
00:12:40
de forma uniforme
00:12:46
E aí eu tenho então meu gel aqui no meu
00:12:51
papel filtro e eu vou colocar esse gel
00:12:53
na parte preta do aparato do aparato de
00:12:58
transferência
00:13:00
E mais uma vez eu vou garantir que não
00:13:02
tem nenhuma bolha de ar entre o papel
00:13:05
filtro e o gel
00:13:09
bom então eu pego a membrana de
00:13:11
nitrocelulose coloca aqui no meu tampão
00:13:14
de transferência que isso é um processo
00:13:16
de transferência molhada que não no qual
00:13:18
nós utilizamos um tampão de
00:13:20
transferência então a membrana vai
00:13:23
encima do gel
00:13:26
eu e mais uma vez eu vou garantir então
00:13:28
que não tenha bolhas de ar agora entre o
00:13:32
gel e a membrana
00:13:34
E aí eu coloco outro papel filtro em
00:13:39
cima agora da membrana mais uma vez
00:13:42
retirar as bolhas de ar agora entre o
00:13:44
papel filtro é membrana vou colocar
00:13:47
outra esponjinha em cima e fechar o
00:13:52
aparato com cuidado vou colocar dentro
00:13:55
do ângulo do aparato da culpa de
00:13:57
transferência ou preto para o lado preto
00:13:59
isso é muito importante para que o
00:14:02
jaupaci as proteínas passem do gel para
00:14:05
membrana porque se eu colocar o
00:14:08
contrário as proteínas vão passar do gel
00:14:10
para o papel depois de preparar todos os
00:14:14
aparatos de transferência e colocá-los
00:14:16
dentro da Cuba eu vou encher essa Cuba
00:14:19
com um tampão de transferência que
00:14:21
contém metanol Vinte por cento de
00:14:24
metanol Esse é o protocolo do nosso
00:14:26
laboratório em seguida eu vou colocar
00:14:30
dois cubinhos de gelo dentro para que
00:14:32
essa esse processo não Skin
00:14:34
o vento e o gel de reta ou se perca
00:14:37
proteínas nesse processo uma vez que
00:14:39
passa corrente elétrica ocorre um
00:14:42
processo de aquecimento desse tampão
00:14:46
eu vou colocar a parte preta da tampa do
00:14:49
lado preto para sempre garantir que
00:14:52
correntinha passado negativo para o
00:14:54
positivo
00:14:56
e eu faço o processo de transferência
00:14:58
dentro da geladeira aí eu programo para
00:15:01
104 volts a minha amperagem é varia
00:15:05
durante 90 minutos Coloca ele para
00:15:07
correr e aqui se vocês observarem começa
00:15:11
a sair umas bolinhas de ar do lado preto
00:15:14
que seria o k tudo lado negativo aqui da
00:15:18
nossa culpa de transferência e do lado
00:15:20
vermelho não sai nenhuma bolinha Por que
00:15:22
não tá passando corrente porque a gente
00:15:24
vai do negativo para o positivo
00:15:27
bom então finalizado com uma
00:15:31
E aí
00:15:33
E aí
00:15:36
E aí
00:15:46
e o meu Jão que antes estava na parte
00:15:49
preta né ficou aqui em cima da membrana
00:15:50
vou tirar eles
00:15:55
e não é possível ver as proteínas foram
00:15:58
transferidas para membrana
00:16:01
a nova deixado que confiro se de fato as
00:16:09
proteínas estão aqui ó
00:16:15
e mostrar pra vocês então a marca dos
00:16:19
proteínas o que como ela se apresentam
00:16:23
aqui nesse na minha ele essas manchinhas
00:16:30
Então as proteínas eu vou deixar uma
00:16:33
foto melhor do Poço para você ver eu sei
00:16:36
que realmente as proteínas que eles
00:16:37
estavam no Gel agora tava querendo
00:16:39
lembrando depois que eu faço um só eu
00:16:43
lavo esse outro só um corante Mesmo com
00:16:46
tempo ele vai me levar melhor acho que
00:16:49
dá uma imagem melhor eu lavo com uma
00:16:51
solução permite uma solução Basalto
00:16:54
simples ai ai
00:16:56
e essa esse Rosinha sai então todo esse
00:17:00
lavando aqui e eu vou até uma membrana
00:17:03
limpa de novo e
00:17:05
há 20 minutos 30 minutos que nós lavamos
00:17:09
essa membrana iremos totalmente corante
00:17:12
trás
00:17:14
e o leite ou pode ter Albumina que a
00:17:19
proteína
00:17:20
e ela
00:17:25
como evitar
00:17:29
é de interesse
00:17:35
bom então
00:17:38
e é com leite durante uma hora na
00:17:41
meditação e
00:17:49
Bom vamos lá como que
00:17:51
eu tô nesse processo para reconhecer a
00:17:54
proteína específica que eu quero Como
00:17:56
que o anticorpo faz isso então lá na
00:17:58
minha
00:18:01
a amostra de música e foi o que eu te
00:18:04
liguei lá no hospital ela vai vender
00:18:06
diversos tipos de proteína Então lá vai
00:18:09
ter beta-actina a
00:18:13
Tu vai querer que eu digo nada
00:18:22
E aí
00:18:29
E aí
00:18:34
Ah tá
00:18:40
em diversos tipos de proteína lá mas eu
00:18:44
quero só
00:18:45
eu posso saber quanto desperta que tina
00:18:50
tem nas para mim amor tá
00:18:53
E aí
00:18:56
e tomando a minha mostra vai ter um
00:19:05
E como que o meu anticorpo Se liga só
00:19:09
abacate
00:19:13
E aí
00:19:15
[Música]
00:19:17
e ele não vai reconhecer
00:19:20
E aí
00:19:26
E então como eu ia dizendo antes de ser
00:19:29
interrompida pelo Meu experimento é
00:19:33
oi oi
00:19:35
é né n
00:19:39
e ele não vai poder conhecer a minha tá
00:19:44
porque se aparecer um ante pé da Quina
00:19:48
tá E hoje eu escrevo devagar
00:19:53
o BH
00:20:01
E aí
00:20:04
Bom dia
00:20:05
E aí
00:20:09
E aí
00:20:12
E aí
00:20:17
e onde esses anticorpos são produzidos
00:20:20
eles são produzidos em animais tá então
00:20:23
eles
00:20:24
E aí
00:20:29
E aí
00:20:32
bom então produzidos de Matos
00:20:39
o cabra
00:20:45
e eles têm algumas outras espécies mas
00:20:48
as pessoas mais conheço uma vez o
00:20:52
conhecido então meu anjo primário se eu
00:20:54
consigo a minha proteínas de interesse
00:20:57
como eu estou primários
00:20:59
E para isso ainda não tá eu vou precisar
00:21:03
encubar
00:21:04
Eu só fiquei com dado que você realmente
00:21:07
Quanto tempo demora essa ligação
00:21:09
primária para acontecer do meu anjo
00:21:11
porque a minha proteína Depende se eu
00:21:14
quiser a medida da geladeira quatro grau
00:21:17
a 4° a isso vai demorar aproximadamente
00:21:20
12 horas a gente sempre deixe de um
00:21:23
Oi tá de vida
00:21:25
e é isso aí
00:21:27
O que é mais quentinho é isso pode
00:21:30
demorar cerca de quatro horas eu vou
00:21:32
fazer dentro da geladeira né vou deixar
00:21:34
e o dia para
00:21:38
o processo o meu anticorpo primário e
00:21:48
a passar as minhas 12 horas eu vou tirar
00:21:52
a minha membrana é desse tipo primário
00:21:54
vou lavar ela de novo negócio do som
00:21:56
basal para tirar Ofício e eu Vou
00:21:59
empurrar Essa sou testar lembrando em
00:22:01
uma solução diante por você cuidar
00:22:05
vou mandar ele vai conseguir no antes
00:22:08
espera tá então por exemplo
00:22:11
o primário de beta-actina foi produzido
00:22:15
e Coelho o meu anticorpo secundário tem
00:22:19
que ter um Antico ele tá e o que que tem
00:22:22
esse anticorpo secundário ligado Aonde
00:22:24
estamos secundárias Isso inclui off que
00:22:27
ele que vá
00:22:29
a reação com uma substância aqui e me
00:22:32
ilumina tem para que a gente visualize
00:22:34
as proteínas ou que a gente chama de
00:22:36
plantas tá então lá na minha
00:22:40
e da parte que é na parte do meu
00:22:42
anticorpo secundário então
00:22:46
Oi meu anjo foi primário ligado a minha
00:22:50
proteína
00:22:54
E aí
00:22:57
E aí
00:23:02
Ah mas não tem ligação
00:23:06
o capitão o meu anjo corpo secundário é
00:23:15
E então como eu disse o meu primário foi
00:23:18
produzido em escolher então eu vou lá e
00:23:21
coloco secundária frente com ele
00:23:33
G1
00:23:34
E aí
00:23:37
Ah tá
00:23:40
E aí
00:23:43
E aí
00:23:50
E aí
00:23:52
oi oi
00:23:55
E aí
00:23:59
e desligar o
00:24:03
E aí
00:24:07
E aí vai lá e vai depois
00:24:19
E aí
00:24:32
em pouco tempo então vai ficar uma de
00:24:37
corpo secundária cerca de uma hora uma
00:24:40
hora que eu ia depende do protocolo do
00:24:41
laboratório tá então aqui no meu nome é
00:24:44
o próximo de laboratório A gente deixa
00:24:46
60 minutos na temperatura ambiente mês
00:24:50
bom então passado esse tempo lá
00:24:54
E aí
00:25:04
bom então vamos cozinhar aqui
00:25:11
o cozinheiro
00:25:15
E aí
00:25:16
[Música]
00:25:19
E aí
00:25:29
e quando eu colocar uma solução
00:25:33
quimiluminescente que nós conhecer como
00:25:36
esse L ta o luminol
00:25:43
E aí
00:25:45
E aí
00:25:49
o que isso imita luta é pouco revelar
00:25:53
uma foto como fazer um raio-x por
00:25:56
exemplo e os produtos ela consegui em
00:25:59
março né queimasse e eles
00:26:08
E aí
00:26:13
só visualizando as proteínas
00:26:20
E aí
00:26:23
E aí
00:26:28
Tá certo então como por exemplo é eu
00:26:32
consigo dizer se tem mais ou menos que o
00:26:36
meu a minha intervenção se eu vejo fiz
00:26:40
meu alimento a minha droga que eu
00:26:41
utilizei lá naquele experimento ela foi
00:26:44
aumentou o Diminuir a quantidade daquela
00:26:46
proteína mais tempo pela força com que
00:26:51
esta semana cês vão estar com a gente lá
00:26:53
embaixo e por exemplo se eu tiver assim
00:26:55
mais forte e mais marquinha aqui
00:27:01
E aí
00:27:09
bom então aqui tivesse
00:27:13
E aí
00:27:18
e aqui então pra finalizar eu já deixei
00:27:23
na minha solução de corpo todo
00:27:24
secundário público uma hora já lavei ela
00:27:27
minha membrana que agora eu vou colocar
00:27:30
aqui do luminol que é feito dessas duas
00:27:33
substâncias aqui na minha lembrança
00:27:37
E aí
00:27:44
E aí
00:27:45
bom então eu coloco as minhas membranas
00:27:49
aqui dentro dessa máquina que nós
00:27:51
chamamos de foto documentadora
00:27:54
e verificamos se tá alinhado fechamos a
00:27:57
nossa máquina
00:27:59
nós iniciamos o processo de revelação
00:28:03
bom então é a máquina vai contar o tempo
00:28:07
e vai revelar as proteínas Essas são as
00:28:10
gurias do adote me apesar de trabalhoso
00:28:13
é uma técnica interessante é importante
00:28:15
é em termos laboratoriais porque ele
00:28:18
permite que nós só somos a quantificação
00:28:22
é diferente porque amostra seja ela
00:28:25
células sejam ela amostras de diferentes
00:28:28
tecidos músculo cérebro
00:28:32
o fígado de animais ou até mesmo amostra
00:28:35
humana então gente ficar alguma dúvida a
00:28:38
respeito do processo de Western blot ao
00:28:41
longo dos anos Vocês ainda vão ver
00:28:43
bastante a presença dessa técnica em
00:28:46
artigo científico e de determinadas
00:28:48
áreas são é só procurar gente
