Key Steps of Molecular Cloning

00:07:20
https://www.youtube.com/watch?v=sjwNtQYLKeU

概要

TLDRMolekylær kloning er en teknikk hvor et spesifikt DNA-fragment isoleres og settes inn i en plasmidvektor, slik at det kan amplifiseres og studeres i detalj. En plasmidvektor er en sirkulær DNA-struktur som lett kan replikeres i E. coli og manipuleres i laboratoriet. Prosessen begynner med behandling av både DNA-fragment og plasmidvektor med restriksjonsenzymer, som cleaver DNAet for å skape overhengende ender som kan sammenføyes med DNA-ligase. Deretter introduseres denne DNA-blandingen i E. coli gjennom transformasjonsprosessen. Celler som har tatt opp plasmidene velges ved hjelp av antibiotikaresistens, noe som resulterer i kolonidannelse. Disse klonene dyrkes videre, og DNAet ekstraheres for videre bruk i forskningen. Teknikken tillater enkel amplifikasjon og langvarig lagring av DNA, samt mulighet for funksjonelle studier av gener.

収穫

  • 🔬 Molekylær kloning isolerer og overfører spesifikke DNA-fragmenter til plasmidvektorer.
  • 🧬 Plasmidvektorer inneholder replikasjonsopprinnelse, seleksjonsmarkører og multiklonsätter.
  • 🔗 DNA-ligase sammenføyer vektor og innsatt DNA til et intakt molekyl.
  • 🌡️ Transformasjon involverer temperaturendringer for å introdusere DNA i E. coli.
  • 🧫 Antibiotika selekterer celler som har tatt opp plasmider under transformasjon.
  • 📈 Amplifikasjon av DNA i E. coli muliggjør dypere genetiske studier.
  • 🧪 Restriksjonsenzymer gir overhengende ender for kloning.
  • 🗂️ Lagret DNA kan brukes for langvarige funksjonelle studier.
  • ⚗️ E. coli er en foretrukket vert på grunn av enkel manipulasjon av plasmider.
  • 🔍 Multiklonsät muliggjør multippel kløyving med restriksjonsenzymer.

タイムライン

  • 00:00:00 - 00:07:20

    Molekylær kloning er prosessen med isolering av et spesifikt DNA-fragment og overføring av dette fragmentet til en plasmid-vektor. Etter å ha blitt en del av plasmid-vektoren, kan DNA-fragmentet lett amplifiseres, sekvenseres, lagres over lang tid, og brukes til genuttrykk og andre funksjonelle studier. To startingredienser for molekylær kloning er en plasmid-vektor og et DNA-fragment som skal settes inn i det. Fragmentet er ofte et gen eller en annen funksjonell region fra en levende celle, men kan også være en kunstig sekvens med egenskaper nyttige for forskeren. Plasmid-vektoren er et sirkulært stykke DNA som enkelt kan amplifiseres i E. coli, lagres lenge, og manipuleres enkelt i et prøverør.

マインドマップ

Mind Map

よくある質問

  • Hva er molekylær kloning?

    Molekylær kloning er en prosess der et spesifikt DNA-fragment isoleres og overføres til en plasmidvektor.

  • Hva består en typisk plasmidvektor av?

    En typisk plasmidvektor har en replikasjonsopprinnelse, et seleksjonsmarkørgen (som gir antibiotikaresistens) og et multiklonsæt som kan kløyves av restriksjonsenzymer.

  • Hvordan forberedes DNA-fragmentet og plasmidvektoren for kloning?

    De behandles med restriksjonsenzymer som kløyver DNA-molekylene og produserer overhengende enkeltstrengede nukleotidhaler.

  • Hva er rollen til DNA-ligase i molekylær kloning?

    DNA-ligase er enzymet som fusjonerer de komplimentære endene av vektor- og innsatt DNA til ett intakt DNA-molekyl.

  • Hva er transformasjon i sammenheng med molekylær kloning?

    Transformasjon er prosessen der ligasjonsblandingen introduseres inni E. coli-cellene, og deretter selekteres celler med plasmider ved hjelp av antibiotika.

  • Hva skjer med klonene etter transformasjonen?

    De selekterte klonene vokser videre i et flytende medium, og DNAet blir deretter ekstrahert fra dem for videre analyser.

  • Hvordan sikres ekspresjonen av innført gen i en vertscelle?

    Vectormultiplikasjonsted kan omgis av promotor- og terminatorkoder som styrer ekspresjonen av innsatte gener.

  • Hvorfor brukes E. coli i molekylær kloning?

    E. coli brukes fordi det er en velstudert organisme der plasmidvektoren enkelt kan amplifiseres og manipuleres.

  • Hva er formålet med en seleksjonsmarkør i en plasmidvektor?

    Seleksjonsmarkøren, som et antibiotikaresistensgen, hjelper med å identifisere celler som har tatt opp plasmidvektoren.

  • Hva er multiklonsätta i en plasmidvektor?

    Multiklonsättet er et område i plasmidvektoren som kan kløyves med forskjellige restriksjonsenzymer for å få plass til innført DNA.

ビデオをもっと見る

AIを活用したYouTubeの無料動画要約に即アクセス！
字幕
en
オートスクロール:
  • 00:00:01
    Molecular cloning is a process of isolation of a specific DNA fragment and transfer of
  • 00:00:05
    this fragment into a plasmid vector.
  • 00:00:13
    As a part of the plasmid vector, the DNA fragment could be easily amplified, sequenced, stored
  • 00:00:18
    for long periods of time, and used for gene expression and other functional studies.
  • 00:00:36
    Two starting ingredients of molecular cloning are a plasmid vector and a DNA fragment that
  • 00:00:41
    has to be inserted in it.
  • 00:00:43
    The DNA fragment is usually a gene or other functional region from a living cell, or it
  • 00:00:47
    could be an artificial sequence with properties useful for a researcher.
  • 00:00:59
    Plasmid vector is circular piece of DNA that could be easily amplified in E. coli, stored
  • 00:01:04
    for long periods of time, and easily manipulated in a test tube.
  • 00:01:08
    A typical plasmid vector contains:
  • 00:01:11
    - an origin of replication that allows it to be replicated inside a bacterial cell;
  • 00:01:16
    - a selection marker, for example a beta lactamase gene coding for ampicillin resistance;
  • 00:01:20
    - and a multiple cloning site , which could be cleaved with several restriction enzymes,
  • 00:01:25
    such as BamHI (G-GATCC), EcoRI (G-AATTC) or NcoI (C-CATGG).
  • 00:01:29
    In many vectors, the multiple cloning site is surrounded by sequences of promoter and
  • 00:01:33
    terminator, that guide expression of inserted genes after the vector is introduced inside
  • 00:01:38
    a cell.
  • 00:01:41
    To be used for molecular cloning, both vector and insert DNA are treated with restriction
  • 00:01:46
    enzymes that cleave double stranded DNA molecules producing overhanging single stranded nucleotide
  • 00:01:52
    tails.
  • 00:03:05
    After their ends have been prepared with restriction enzymes, vector and insert are combined together,
  • 00:03:10
    and another enzyme, called a DNA ligase is added to
  • 00:03:24
    the mix.
  • 00:03:27
    At the same time as complimentary base pairing of single stranded overhands brings the ends
  • 00:04:22
    of vector and insert together, the DNA ligase fuses them into one intact DNA molecule.
  • 00:04:37
    In order to make multiple copies of this molecule, the ligation mixture is introduced inside
  • 00:04:42
    the E. coli cells in a process called transformation.
  • 00:05:05
    During the transformation the cell-DNA mixture is kept on ice and then exposed to 42 oC.
  • 00:05:11
    Such sudden change in temperature drives the DNA inside some of the E. coli cells.
  • 00:05:16
    Then the cells are plated on a plate with growth medium supplemented with a selective
  • 00:05:20
    antibiotic.
  • 00:05:22
    Only the cells that acquired the plasmid have resistance to the antibiotic and are capable
  • 00:05:26
    of growth on such a medium.
  • 00:05:28
    After overnight incubation at 37 oC each transformed cell produces a colony of identical cells,
  • 00:05:34
    oftentimes called a clone.
  • 00:05:40
    The selected clones are then individually picked, grown even further in a liquid medium,
  • 00:05:49
    and the DNA is extracted from them.
  • 00:06:09
    Thus, in the process of molecular cloning, a DNA fragment that represented a tiny fraction
  • 00:06:50
    of cell genome is integrated into a bacterial plasmid.
  • 00:06:53
    As a part of a plasmid, this DNA fragment represents a quarter or more of total DNA
  • 00:06:58
    in a test tube and it could be effortlessly and endlessly amplified in E. coli.
タグ
  • molekylær kloning
  • plasmidvektor
  • DNA-fragment
  • restriksjonsenzymer
  • E. coli
  • transformasjon
  • DNA-ligase
  • antibiotikaresistens
  • multiklonsät
  • replikasjon