00:00:16
Selamat datang kembali ke channel ini.
00:00:18
Kita akan membahas suatu pembahasan yang
00:00:20
menarik ya, khususnya dari teman-teman
00:00:23
mahasiswa ya yang mengambil analisis
00:00:25
obat dan makanan ya. Kita akan bahas
00:00:28
terkait clean up. Apa itu clean up? Ya,
00:00:32
secara definisi ya kita dapat
00:00:35
definisikan yaitu proses pembersihan.
00:00:37
Clean up. Clean berarti menghilangkan
00:00:40
zat-zat
00:00:42
pengotor dari sampel atau larutan untuk
00:00:45
tujuan memperoleh hasil analisis yang
00:00:48
akurat dan andal. Jadi, clean up ini
00:00:50
lebih ke proses ee preparasi,
00:00:53
Teman-teman, ya. Bukan ke arah ke
00:00:55
analisisannya. ya nanti kita bahas ya di
00:00:59
ee pertemuan berikutnya ya.
00:01:02
Langkah-langkah ini sangat penting dalam
00:01:05
memastikan bahwa hasil akhir analisa
00:01:08
tidak dipengaruhi oleh keberadaan
00:01:10
zat-zat yang tidak diinginkan. Jadi kita
00:01:13
ingin memfaksinya atau
00:01:15
memisahkannya ya untuk memberikan data
00:01:18
yang valid. Jadi strategi dari clean up
00:01:20
itu ada dua ya. Ada yang high resolution
00:01:23
jadi ada campuran AB CD ya. kita pecah
00:01:27
atau sparation-nya menjadi A, B, C, dan
00:01:30
D ya menjadi fractionation or atau
00:01:36
campuran ABCD. Nah, kita hanya
00:01:38
menginginkan yang A. Jadi, kita bisa
00:01:40
pisahkan campuran ini adalah group
00:01:43
spiration ya. Pada kali ini kita akan
00:01:47
membahas salah satunya adalah S
00:01:49
exclusion
00:01:50
chromatography ya. ini sistemnya ee
00:01:54
kalau kita lihat dilihat dari sini ada
00:01:56
kromatografi dan ada tulisan ukuran ya.
00:02:00
sinonim dari beberapa eh metode ini ada
00:02:04
gel exclusion chromatography, molecular
00:02:07
exclusion
00:02:08
chromatography, ses exclusion
00:02:10
chromatography, gel filtration
00:02:13
chromatography. Jadi teknik ini
00:02:16
memisahkan berdasarkan ukuran molekul
00:02:21
melibatkan penggunaan butiran ya.
00:02:24
Butiran jadi pori-pori atau yang suatu
00:02:27
butiran yang memiliki pori kecil atau
00:02:30
terowongan ya yang dalamnya yang di
00:02:32
dalamnya yang masing-masing mempunyai
00:02:34
ukuran yang presisi ya. Ukuran tunel
00:02:38
atau ukuran terowongan ini merucus eh
00:02:41
exclusion limit ya. di mana ukuran yang
00:02:43
lebih besar ya biasanya ada molekul yang
00:02:45
lebih besar dia tidak akan masuk ke
00:02:47
dalam terowongan dan dia akan melewati
00:02:50
atau
00:02:51
tereeluasi melalui celah-celah di antara
00:02:55
butiran ya. Metode ini memungkinkan
00:02:58
pemisahan berdasarkan
00:03:00
ukurannya ya. Jadi metode ini sangat
00:03:04
bergantung pada pertukaran molekul yang
00:03:08
zat terlarut antara pelarut dalam fase
00:03:10
gerak dan pelarut yang sama yang berada
00:03:13
di dalam pori-pori dalam ee bahan
00:03:16
pengisi. Jadi benar-benar menentukan
00:03:19
jenis molekul dipisahkan berdasarkan
00:03:21
ukuran pori-pori bahan
00:03:24
pengisi ya. Bagian-bagian dari SEC.
00:03:27
Kalau lihat dari sini mulai dari sini
00:03:29
mobile face mobile face dalam
00:03:33
kromatografi SEC atau kromatografi
00:03:35
eksklusif ukuran pilihan pelarut sangat
00:03:38
menentukan keberhasilan analisis. Jenis
00:03:41
pelarut yang digunakan bisa bangat
00:03:44
bervariasi ya, mulai dari yang nonpolar
00:03:48
seperti THF,
00:03:50
tetrahidrofuran hingga pelarut yang
00:03:52
paling ee berbasis air atau polar yaitu
00:03:55
air. Ya, tergantung jenis sampel apakah
00:04:00
berupa polimer, bahan kimia besar
00:04:03
biasanya atau
00:04:05
protein ya. pelarut yang dipilih harus
00:04:09
mampu melarutkan sampel secara sempurna.
00:04:13
Karena biasanya kolom SEC ya, kolom yang
00:04:16
di sini ya, itu mudah tersumbat untuk
00:04:20
ukuran e untuk partikel yang tidak
00:04:22
larut. Selain itu, pelarut juga harus
00:04:26
kompatibel dengan jenis yang jenis kolom
00:04:29
yang digunakan khususnya untuk analisis
00:04:32
protein ya yang biasanya menggunakan
00:04:35
suatu buffer atau larutan penyangga yang
00:04:38
dapat menjaga struktur protein agar
00:04:41
tetap stabil ya dan aktif selama
00:04:44
pemisahan berlangsung sehingga setelah
00:04:48
eeemilh pelarut ya mobile face baik
00:04:53
nonpolar ya seperti tetrahidroforan
00:04:56
ataupun buffer biasanya untuk menjaga
00:04:58
stabilitas protein. Tahap berikutnya
00:05:01
adalah
00:05:02
proses injection atau menyutikan sampel
00:05:06
ke dalam sistem ya. Beberapa
00:05:08
sistematografi khususnya SEC dilengkapi
00:05:12
auto sampler atau otomatis memungkinkan
00:05:15
penyuntikan otomatis. Ini sangat praktis
00:05:17
teman-teman sebenarnya karena Anda dapat
00:05:20
mengatur urutan sampelnya.
00:05:23
lalu membiarkan alat bekerja sambil Anda
00:05:26
melakukan aktivitas lain. Namun penting
00:05:29
untuk mencatat urutannya. Jangan sampai
00:05:31
dari teman-teman ee kebingungan ini
00:05:34
sampel yang mana agar tidak kebingungan
00:05:36
membaca hasil datanya. Nah, di sisi
00:05:39
lain ada beberapa pemisahan yang
00:05:43
mengharuskan atau memerlukan injeksi
00:05:45
manual. Ya, perlu diingat ya ee untuk
00:05:50
injeksi pada kromatografi ya pakai SP
00:05:53
spit lare yang menggunakan jarum yang
00:05:56
ujungnya tumpul ya. Ini untuk mencegah
00:05:59
kerusakan pada
00:06:01
alat ya. Setelah sampel disuntikkan ya
00:06:06
biasanya masuk ke dalam suatu
00:06:09
kolom ya. Masuk ke dalam suatu kolom ya.
00:06:12
Di sini ada sistem loop. Jadi harus
00:06:14
sampel tersebut harus disuntikkan sesuai
00:06:16
dengan ukuran sistem loop dan masuk ke
00:06:18
dalam suatu kolom ya. Kolom inilah yang
00:06:21
disebut kolom kromatografi ya yang kita
00:06:24
sebut SEC tadi ya. Tabung yang berisi
00:06:27
partikel berpori porus sebagai fase
00:06:30
diam. Partikel ini biasanya ada beberapa
00:06:33
terbuat dari polimer inert bisa avarosa,
00:06:37
selulosa atau dekstran dan harus selalu
00:06:41
dalam keadaan terhidrasi atau basah atau
00:06:47
teraliri. Ya, kolom SEC ini memiliki
00:06:50
rentang kerja yaitu batas atas sama
00:06:53
batas berat molekul yang dapat
00:06:55
dipisahkan secara efektif. Jadi kalian
00:06:58
harus menentukan dulu berapa batas ee
00:07:01
efektif rentang yang perlu dientukan
00:07:04
dari kolom SEC ini. Oleh karena itu,
00:07:07
penting untuk memilih kolom dengan
00:07:09
ukuran pori-pori yang sesuai ya, sesuai
00:07:12
dengan perkiraan molekul sampel Anda.
00:07:15
Jika tidak ya pemisahan bisa gagal dan
00:07:20
Anda akan membuang waktu serta bahan
00:07:23
untuk mencoba-coba ukuran pori-pori yang
00:07:26
cocok.
00:07:28
Ya, selain ukuran pori-pori, kolom baik
00:07:31
juga harus tidak menyebabkan sampel
00:07:34
berinteraksi atau menempel secara non
00:07:37
spesifik, ya. Itu yang harus dipastikan.
00:07:39
Tidak mengubah bentuk atau muatan sampel
00:07:43
ya. Contohnya
00:07:46
terionisasi ya. Dan yang ketiga dan ee
00:07:51
kolom harus memiliki kapasitas muatan
00:07:53
yang sesuai kebutuhan anda ya biasanya
00:07:56
volumenya berapa ya di poin pertama dan
00:08:00
poin kedua tadi yang menyebabkan sampel
00:08:03
bisa berinteraksi, bisa mengubah muatan
00:08:06
atau mengubah bentuk biasanya itu
00:08:08
digunakan untuk melaku ee mencegah
00:08:11
penyumbatan dari kolom ya dan kolom SEC
00:08:16
ya size exclusion dan kromatografi ini
00:08:19
ee biasanya tergolong mahal biasanya
00:08:21
2.000 sampai
00:08:23
3.000. Jadi tolong dijaga baik-baik
00:08:27
kalau kalian memakainya atau
00:08:29
menggunakannya. Oke. Dari situ ee
00:08:33
bagaimana sampel bisa mengalir di sini?
00:08:36
Pasti ada suatu pompa, Teman-teman, ya.
00:08:40
Pompa ini berfungsi untuk mendorong fase
00:08:44
gerak dan sampel, ya. untuk melewati
00:08:48
kolom dalam SEC ya. Ada dua parameter
00:08:52
yang penting, tekanan pompa, yang kedua
00:08:56
adalah laju alir. Dua variabel ini
00:08:59
penting untuk
00:09:01
dikendalikan ya. Jika tekanan terlalu
00:09:04
tinggi ya biasanya akan merusak
00:09:07
sampelnya maupun kolom. Sebaliknya ya
00:09:10
pada SEC tekanan terlalu rendah sampel
00:09:14
mungkin tidak bisa tereluasi atau tidak
00:09:17
keluar jadi kalian harus
00:09:21
menentukannya. Lalu fluorate atau laju
00:09:24
alir ini juga sangat krusial teman-teman
00:09:27
ya. Laju alir yang terlalu lambat akan
00:09:30
membuat percobaan berjalan selama atau
00:09:33
terlalu lama tanpa ada alasan yang jelas
00:09:36
biasanya ya. dan bisa
00:09:39
ee tidak tahu ini kapan akan keluar ya.
00:09:43
Tapi jika terlalu cepat bisa
00:09:46
mengganggu
00:09:48
resolusinya ya. Jadi antara PIK bisa
00:09:51
terganggu atau resolusi kromatografi
00:09:53
bisa menurun ya. Namun ya SEC ini
00:09:59
memiliki beberapa karakteristik
00:10:01
dibandingkan HPLC ya, yang di mana laju
00:10:05
alir yang lebih rendah ya justru
00:10:08
meningkatkan
00:10:10
resolusi ya. Jadi laju alir yang lebih
00:10:13
rendah akan meningkatkan ee resolusi
00:10:16
dari kromatografi SEC ya. di sini ya
00:10:20
akan teralirkan ke detektor unit ya bisa
00:10:25
dikumpulkan beberapa fraksi dan hasilnya
00:10:28
bisa terlihat pada PC dalam bentuk
00:10:31
kromatogram. Kita akan bahas terkait
00:10:33
detektornya ya. Jadi, SEC ini bisa ee
00:10:37
dikaitkan atau dikombinkan dengan
00:10:39
beberapa detektor, yaitu detektor UV,
00:10:42
detektor infrared, infra merah, indeks
00:10:45
bias, refractive index, densitas, small
00:10:49
angel x-ray
00:10:50
scattering, dan yang paling eh kombinasi
00:10:54
yang paling baik adalah kombinasi SEC
00:10:56
dengan detektor index bias dan mal
00:10:59
multiangel light skatering. Ya, teknik
00:11:02
ini memungkinkan penentuan ukuran dan
00:11:05
homogenitas sampel secara jelas. Dan
00:11:08
kombinasi ini adalah golden standar ya.
00:11:11
Metode standar yang paling metode yang
00:11:13
terbaik untuk pemurnian ee protein
00:11:17
membran. Gambarannya akan seperti ini
00:11:20
ya.
00:11:21
akan terkeluar seperti ini. Jadi,
00:11:23
kromatogram itu grafik ya, puncak yang
00:11:27
menunjukkan sampel keluar pada waktu
00:11:29
yang berbeda. Jadi pada waktu berbeda
00:11:31
adalah ee mili ee volume yang dikeluar
00:11:35
di sini. Sedangkan sumbu X e akan
00:11:39
menunjukkan absorbansi ini jika ee
00:11:42
menggunakan detektor UV ya. intensitas
00:11:46
sinyal yang merefleksikan konsentrasi
00:11:48
komponen yang keluar dari
00:11:51
kolom ya. Dengan menggunakan grafik
00:11:54
kalibrasi ya atau kurva baku ya atau
00:11:58
standar kita akan dapat menentukan ya
00:12:01
ukuran ee ukuran partikel yang akan
00:12:04
dapat kalian
00:12:06
hitung ya. Gambarannya akan seperti di
00:12:09
sini sekitar 68 mili ya menunjukkan
00:12:13
volume elusinya.
00:12:15
ya, volume pelarut yang melewati
00:12:20
kolong ya. Di sini menunjukkan sebuah
00:12:23
protein yang murni dan tunggal di sini
00:12:25
karena puncaknya cuma
00:12:28
satu. Oke, kita masuk ke jenis-jenis
00:12:31
polimer yang sering digunakan ya. Ada
00:12:33
tiga, ada Dexstrat ya, Spendrive ya. Ini
00:12:37
adalah mereknya Agarosa dan poli
00:12:40
akrilamida. Poliakrilamid ya. Ciri khas
00:12:44
dari fase diamnya kalau kalian lihat di
00:12:46
sini ya di sini harus bersifat inert.
00:12:50
Itu yang pertama. Yang kedua dan
00:12:52
membentuk struktur tiga dimensi yang
00:12:54
berpori ya karena adanya ikatan silang
00:12:57
antar molekul atau crossling di
00:13:00
sini ya. Ini ada di kerantonan
00:13:02
crossing-nya ya. Jadi kalau kelihatan di
00:13:05
sini ada yang masuk pori terlihat jelas
00:13:07
ilustrasinya ya. yang warnanya merah ya
00:13:10
dia tidak masuk. Sedangkan yang warnanya
00:13:12
biru dia masuk pori-pori sehingga yang
00:13:14
keluar terlebih dahulu yang warnanya
00:13:16
merah
00:13:19
ini.
00:13:21
Oke. Ciri utama gelas dia ya satu tadi
00:13:26
ada derajat ikatan silang dan ukuran
00:13:28
pori yang dikontrol ketat selama proses
00:13:31
pembuatan kolom ya. Umumnya jel bersifat
00:13:36
hidrofilik hingga sehingga ee akan
00:13:39
mengembang teman-teman ya kolom akan
00:13:42
mengembang saat bersentuhan dengan fase
00:13:44
gerak yaitu air. Jelatan silang dan
00:13:48
ukuran pori relatif besar biasanya
00:13:50
membutuhkan volume air yang lebih banyak
00:13:54
untuk mengisi pori-porinya dibandingkan
00:13:57
gel yang lebih rapat ikatan silangnya.
00:14:00
Ya, di sini ada beberapa contoh
00:14:04
eh fase diam sepandek ya 15
00:14:10
75 ya dan ada beberapa karakteristik di
00:14:14
sini ya. Lalu apa yang membedakan?
00:14:16
Contoh satu watery gain ya. watery gain
00:14:20
ya g/g ya ini artinya adalah jumlah air
00:14:24
dalam gram ya dalam gram ya bukan dalam
00:14:27
mili yang dapat diserap oleh setiap gram
00:14:30
gel
00:14:31
kering maknanya apa ini menunjukkan
00:14:35
bahwa kemampuan gel untuk menyerap air
00:14:38
yang berhubungan langsung dengan
00:14:40
porositas dan sifat hidrofilik
00:14:45
geloh water rigennya 1,5 berarti Nanti
00:14:49
dalam 1 gram zel kering dapat menyerap
00:14:53
1,5 gram
00:14:56
air. Oke. Lalu molekular weight ya.
00:15:01
Molekular weight range rentang berat
00:15:04
molekul yang dapat dipisahkan oleh apa?
00:15:08
Gel tersebut menunjukkan kapasitas
00:15:10
pemisahan ukuran molekulnya. Semakin
00:15:13
besar angka ini ya, angka
00:15:18
ini
00:15:19
semakin besar molekul yang bisa
00:15:22
dipisahkan. Contoh sepandek G200 berarti
00:15:26
dia dapat memisahkan hingga
00:15:30
200.000 Dalton ya ukurannya adalah
00:15:33
Dalton. Sedangkan G15 ya dia hanya bisa
00:15:37
memisahkan
00:15:39
1500 Dalton.
00:15:43
Oke, berikutnya tiga. B volume ya. Di
00:15:47
sini volume total ya tertulis
00:15:51
miligram per gram. Milit/ gram sori ya.
00:15:56
G^ -1 itu adalah per gram ya. Di sini
00:16:00
per apa ya? Artinya volume total dari
00:16:04
gel yang sudah mengembang per gram gel
00:16:07
kering. Maknanya apa? Hal ini
00:16:10
menggambarkan suatu ukuran kolom yang
00:16:13
dibutuhkan dan volume pori internal
00:16:16
setelah gel mengembang.
00:16:19
Contoh B volumenya 30 pada SP pendek 200
00:16:24
ya. Artinya 1 gram gel kering
00:16:28
menghasilkan volume gel yang mengembang
00:16:31
sebesar 30 mili ya. Bet volume ini
00:16:36
berkaitan dengan total volume kolom.
00:16:39
yang mempengaruhi waktu retensi zat-zat
00:16:43
terlarutnya ya. Jadi tolong dibedakan
00:16:46
satu tadi watery molecular weight ya bad
00:16:51
volume. Yang terakhir swelling time.
00:16:53
Swelling time ini ya swelling berarti
00:16:55
mengembang atau menyerap ya. Waktu yang
00:16:59
dibutuhkan
00:17:00
oleh air eh gelering untuk menyerap air
00:17:05
ya sampai mencapai kondisi yang jenuh
00:17:07
atau stabil mengembang sempurna. ini
00:17:11
menunjukkan bahwa seberapa cepat gel
00:17:14
siap digunakan. Berarti kalau 72 berarti
00:17:18
dia siap digunakan setelah 72 jam ya.
00:17:22
Berarti di sini 1 hari sependak 75 itu
00:17:25
harus siap digunakan setelah 24 jam. Di
00:17:27
sini 72 jam berarti setelah 3 hari ya.
00:17:33
Contoh
00:17:35
ya saya 15 ya 3 jam berarti di sini ya.
00:17:39
Jadi hubungan antar parameter. Contoh di
00:17:41
sini ya, semakin besar pori
00:17:45
semakin longgar struktur gel. Maka di
00:17:48
sini kalian lihat water
00:17:51
regain ya,
00:17:55
Belling T semakin
00:17:59
besar ya. Dan gel mampu memisahkan
00:18:02
molekul yang lebih besar ya. Saya ulang
00:18:06
lagi, semakin besar
00:18:08
pori ya dan semakin longgar struktur,
00:18:11
maka water regen, bad volume dan
00:18:14
swelling time ya semakin besar juga dan
00:18:19
gel dapat memisahkan ke molekular yang
00:18:23
lebih besar. Dan sebaliknya semakin
00:18:27
rapat ikatan silang, water regain ya,
00:18:31
swelling
00:18:33
time ya, itu akan lebih kecil sehingga
00:18:37
lebih cepat siap tapi hanya memisahkan
00:18:40
molekul yang kecil.
00:18:46
Oke, di sini dalam kromatografi ukuran
00:18:50
SSCC cara kejar cara kerja gel
00:18:54
didasarkan perbedaan ukuran molekul zat
00:18:57
yang
00:18:57
dianalisis ya. Jadi berdasarkan ukuran
00:19:02
molekul dan ukuran pori dari ee ukuran
00:19:04
dari pori dari gel. Zat yang dengan
00:19:07
ukuran besar tidak bisa akan masuk ke
00:19:09
dalam poli-pori gelel sehingga mereka
00:19:13
akan langsung lewat melewati celah antar
00:19:16
partikelnya dan keluar lebih
00:19:21
cepat. Sebaliknya zat yang lebih kecil
00:19:25
biasanya akan masuk ke dalam pori-pori
00:19:27
dan keluar lebih lambat karena
00:19:30
tersangkut sebentar. ya, kita bisa
00:19:32
istilahkan tersangkut sebementar di
00:19:34
dalamnya sehingga bergerak lebih lambat
00:19:37
dan keluar belakangan. Inilah sebabnya
00:19:40
urutan keluarnya elusi zat dari kolom
00:19:43
terjadi berdasarkan ukuran
00:19:47
molekul dari besar yang paling besar ke
00:19:50
paling
00:19:52
kecil ya. Cairan yang digunakan biasanya
00:19:55
air atau larutan penyangga bisa diserap
00:19:57
oleh jel dalam jumlah yang cukup banyak.
00:20:01
cairan di sini berfungsi sebagai pelarut
00:20:04
ee bagi zat yang akan
00:20:07
dianalisa. Ya, berbicara dengan
00:20:10
distribusi zat terlarut ya, distribusi
00:20:12
zat terlarut antara bagian dalam dan
00:20:15
luar z hanya tergantung pada ruang yang
00:20:19
tersedia ya. Dalam kromatografi SEC ya,
00:20:23
kolom diisi partikel gel ya, contoh
00:20:26
spandek ya, memiliki pori-pori yang
00:20:28
kecil ya. Ketika larutan zat ya yang
00:20:32
terlarut atau solut mengalir melewati
00:20:35
kolom, molekul-molekul solut bisa berada
00:20:38
di dua tempat. Satu ya dia dapat di luar
00:20:43
partikel gel atau di ruang antar
00:20:46
partikel atau intersal space ya atau
00:20:51
yang kedua di dalam partikel gel ya dan
00:20:54
masuk ke dalam pori-pori ya. ya, masuk
00:20:58
ke dalam butiran gel yang disebut
00:21:00
matriks biasanya ya. Tapi perlu kalian
00:21:02
ingat ya di sini ini pemisahannya tidak
00:21:05
dipengaruhi oleh pH, kekuatan ion maupun
00:21:09
konsentrasi
00:21:13
pelarut.
00:21:15
Oke, ada hal yang penting lagi ya untuk
00:21:18
menjadi indikator kunci ya. Sebenarnya
00:21:22
pada kali ini pada slide ini saya hanya
00:21:24
menjelaskan satu ya. Ada dua sebenarnya,
00:21:27
yakni satu koefisien distribusi, ya.
00:21:31
Koefisien distribusi itu menjelaskan ee
00:21:34
seberapa jauh suatu molekul bisa masuk
00:21:37
ke dalam pori-pori gel dibandingkan
00:21:40
total volume kolom. Yang kedua adalah
00:21:43
efisiensi kolom dalam pemisahan.
00:21:46
Seberapa ee kolom dapat menunjukkan
00:21:50
resolusi yang lebih baik. Ya, kita akan
00:21:52
fokus ke koefisiensi
00:21:56
distribusi
00:21:58
ya. KD menggambarkan posisi molekul
00:22:02
dalam jalur elusi. Apakah molekul
00:22:05
tersebut masuk penuh ke dalam
00:22:08
pori-pori hanya sebagian atau tidak
00:22:11
masuk sama sekali, Teman-teman? Jadi, KD
00:22:14
itu menunjukkan seberapa jauh suatu
00:22:16
molekul bisa masuk ke dalam pori-pori
00:22:20
dibandingkan dengan total volumenya ya.
00:22:24
KD akan menunjukkan apakah suatu molekul
00:22:27
tadi ya hanya lewat ya masuk sebagian
00:22:30
atau hanya atau benar-benar masuk ke
00:22:33
pori-pori. Kalau dilihat dari rumusnya
00:22:36
KD itu ya terhitung dari volume retensi
00:22:40
dari komponen yang diuji VR ya di sini
00:22:44
berapa banyak larutan yang dibutuhkan
00:22:45
untuk mendorong komponen ini untuk
00:22:47
keluar dikurangi fenol volume eksklusif
00:22:51
jadi volume pertama retensi komponen
00:22:53
yang sangat besar nanti ada salah satu
00:22:56
ee indikatornya ya yang tidak masuk ke
00:22:59
pori-pori ya ini ada fenol jadi volume
00:23:02
eksklusi pertama Jadi volume V0 ini
00:23:05
bukan 0 mili ya, tapi nanti ada
00:23:07
ukurannya. Dan vt volume total permeasi
00:23:11
ya tentang retensi volume komponen kecil
00:23:14
yang bisa masuk semua ke pori-pori ya
00:23:17
ini adalah biasanya total dari volume
00:23:21
permeasinya atau ee semua total total
00:23:25
dari volume kolomnya. Kalau dilihat dari
00:23:28
nilai KD ya, KDAR dari 0 sampai 1 atau 0
00:23:34
sampai 1. Jadi kalau 0 molekul sangat
00:23:37
besar, terlalu besar sehingga tidak
00:23:39
masuk ke dalam pori-pori. KD = 1 molekul
00:23:44
sangat kecil sehingga hampir seluruhnya
00:23:46
masuk ke dalam pori-pori gel. Di antara
00:23:49
itu masuk sebagian pori-pori tergantung
00:23:54
ukurannya ya.
00:23:58
Oke, ya. Kita masuk lagi ke sini, ya.
00:24:01
Karakteristik fase diam, ya. Di sini ya,
00:24:05
dalam kromatografi eksklusi ukaran ya,
00:24:08
SEJ, pemisahan terjadi berdasarkan
00:24:11
perbedaan ukuran ya. Untuk itu bahan
00:24:14
pengisi harus memiliki
00:24:16
struktur ya, sesuai agar zat ee dengan
00:24:21
ukuran berbeda bisa dipisahkan dengan
00:24:24
efisien ya. Pada kali ini kita melihat
00:24:27
bahan yang ee umum yaitu
00:24:31
agarosa ya. Ada agarosa yang
00:24:34
tercrossling dan silika gel ya. Setiap
00:24:38
bahan ya memiliki bentuk,
00:24:41
ukuran ya, rentang berat molekul yang
00:24:44
dapat dipisahkan dan
00:24:46
kompatibilitas dengan pelarut tertentu.
00:24:49
Ya, di sini ada kompatibilitas dengan
00:24:52
contoh silikal nih dengan pH2 sampai
00:24:55
dengan p8 dan pelarut organik ya. Tidak
00:24:57
hanya ya pelarutnya sehingga pelarut
00:25:00
organik ya. Pemilihan ini sangat penting
00:25:03
agar SEC bekerja dengan optimal
00:25:06
tergantung sifat zat yang
00:25:07
dianalisis ya. Contoh Agarosa di sini
00:25:10
dia mengembang sampai 60 sampai 140
00:25:14
mikrm. Suspensinya dalam air ya.
00:25:17
Rentangnya berapa di sini? 6 * 10^ 4
00:25:20
sampai 2 * 10^ 7. Di sini digunakan
00:25:24
untuk protein yang ideal.
00:25:26
Agarosa yang tercrossling ya di sini ya
00:25:32
perbedaannya dengan agarosa yang biasa
00:25:34
seperti apa di sini ya dia bisa untuk
00:25:38
polisakarida 3 * 10^ 3 sampai 5 * 10^ 6
00:25:43
di sini lebih stabil selektif ya untuk
00:25:46
biomolekul yang lebih
00:25:49
kompleks ya lalu silika gel ya serbuk
00:25:53
halus ukuran 10 mikrm meter ya dengan
00:25:56
pori kurang lebih 30 nanm ya kucil
00:26:00
banget ya biasanya di sini digunakan
00:26:03
dengan protein 1 * 10^ 3 sampai 3 10^ 5
00:26:08
lebih kecil
00:26:11
teman-teman ya dan polisakarianya ukuran
00:26:14
sama dan
00:26:16
kompatibilitasnya dia menjamin pada pH
00:26:18
yang lebih
00:26:22
lebar oke ya Di sini tadi ketemu istilah
00:26:27
fenol atau void volume ya. Void volume
00:26:31
ya di SEC ya volume terbagi menjadi dua
00:26:36
ya sekitar
00:26:39
sepertiganya volume awal atau disebut
00:26:43
void volume ya. Sedangkan ya
00:26:48
2/3-nya ya itu adalah volume pori-pori
00:26:52
yang masuk di dalam Z ya. Jadi volume
00:26:55
pertama sepertiga itu adalah ruang antar
00:26:57
gel, volume antar partikel gel.
00:27:00
Sedangkan 2/3 itu adalah volume
00:27:03
pori-pori di mana tempat molekul kecil
00:27:06
dapat
00:27:09
masuk. Ya, volume besar biasanya cepat
00:27:13
ya, dia biasanya mendekati V0 atau void
00:27:16
volume-nya.
00:27:18
Nah, di
00:27:20
sini ya hal yang menarik ya hal yang
00:27:23
menarik
00:27:25
adalah
00:27:27
ee
00:27:28
pemisahannya ya.
00:27:32
Biasanya untuk memperoleh hasil
00:27:34
pemisahan yang baik, molekul yang ingin
00:27:37
dipisahkan ya biasanya memiliki
00:27:40
perbedaan ukuran minimal sekitar 10%.
00:27:44
Ya, dengan perbedaan ini ya,
00:27:47
puncak-puncak dari elusi akan terpisah
00:27:50
dengan jelas sehingga resolusi
00:27:52
kromatogram dapat diterima. Di sini
00:27:55
kalau ilustrasinya kita lihat ya, di
00:27:58
sini akan keluar siapa yang keluar dulu
00:28:00
ya, akan ukuran yang paling besar
00:28:04
dulu. Nah, ukuran yang paling besar
00:28:07
habis itu yang ee menengah dan yang
00:28:10
terakhir yang hijau adalah yang small.
00:28:18
Oke, bagaimana aplikasinya dalam farmasi
00:28:21
ini lebih penting? Ya, satu untuk
00:28:24
mengetahui perbandingan, ya perbandingan
00:28:27
jumlah atau komposisi dari masing-masing
00:28:29
komponen dalam suatu sampel. Dan yang
00:28:33
kedua adalah menentukan berat molekul
00:28:36
zat yang dianalisa.
00:28:41
Ya, di sini yang pertama untuk
00:28:44
mengetahui perbandingan jumlah atau
00:28:46
komposisi dari masing-masing komponen
00:28:48
dalam sampel ya, ada dua situasi yang
00:28:52
mungkin terjadi ya. satu ekivalen ya,
00:28:56
equivalent respon ini terjadi ketika
00:28:59
semua komponen ya dalam sampel
00:29:01
memberikan sinyal yang sama terhadap
00:29:03
detektor. Artinya bagaimana jika
00:29:06
komponen A dan komponen B jika memiliki
00:29:10
jumlah molekul yang sama maka sinyal
00:29:12
atau puncak yang muncul di kromatogram
00:29:15
juga akan sama. Jadi kalau sama kita
00:29:19
dapat menghitung berarti hanya melihat
00:29:21
dari luas masing-masing komponen di
00:29:25
kromatogram ya. Jumlah semua luas yang
00:29:28
penting ya dianalisa ya dan dibagi
00:29:32
dengan luas komponen e puncak-puncak
00:29:34
masing-masing dengan total luas
00:29:36
puncaknya hasilnya akan dapat
00:29:39
presentasenya ya. Yang tidak bisa kita
00:29:42
duga adalah non equivalent respon.
00:29:46
Jika ketika komponen dalam sampel
00:29:49
menghasilkan sinyal-sinyal yang berbeda,
00:29:51
artinya contoh komponen A dan B dengan
00:29:55
jumlah molekul yang sama bisa
00:29:57
menghasilkan puncak dengan yang lebih
00:29:59
tinggi atau luas yang berbeda ya karena
00:30:03
perbedaan sensitivitas detektornya
00:30:05
mungkin seperti itu ya. Sehingga kita
00:30:08
tidak bisa hanya membandingkan luas-luas
00:30:11
puncaknya tapi kita harus menggunakan
00:30:13
kurva kalibrasi. yang dibuat dari
00:30:16
standar yang sudah diketahui
00:30:21
konsentrasinya ya. Fa kalibrasi ini
00:30:24
menghubungkan ee berapa jumlah ya
00:30:27
berdasarkan konsentrasi yang sebenarnya.
00:30:29
Jadi hal ini sedikit berbeda
00:30:34
ya. Kalau respon ekivalen dia kita bisa
00:30:37
langsung membandingkan langsung. Tapi
00:30:39
kalau non ekuivalen kita harus mempunyai
00:30:41
kurva kalibrasi berdasarkan
00:30:43
standar-standar
00:30:45
tertentu. Contoh seperti
00:30:47
ini. Kalau ini adalah suatu ekivalen ya
00:30:52
kita hanya bisa membandingkannya ya.
00:30:55
Kita bisa membandingkan ee puncak area
00:30:57
yang di sini dengan puncak area yang di
00:31:00
sini ya. Dasasarkan di sini high
00:31:02
molecular W dulu, intermedi molecular W
00:31:04
dan Light. Dan di sini ya, di sini ada
00:31:09
V0 ya. V0 ini biasanya diketahui atau
00:31:12
kita memaksudkan suatu komponen sehingga
00:31:15
akan keluar ya benar-benar molekul apa
00:31:19
suatu ee senyawa yang tidak benar tidak
00:31:22
bisa
00:31:23
masuk. Nah, kalau di sini satu strategi
00:31:26
pemisahannya high resolusi frination ya.
00:31:29
Jadi kita bisa memisahkan
00:31:31
beberapa ya beberapa komponen yang ada
00:31:34
di sini.
00:31:37
Oke, kita akan masuk ke menentukan berat
00:31:39
molekul yang ada akan
00:31:42
dianalisa ya. Jadi, yang di awal yang
00:31:45
kita lakukan adalah suatu ee kita
00:31:48
memilih standar kalibrasi dengan berat
00:31:50
molekul ya. Ya, di sini ukuran molekul
00:31:54
utamanya dalam rentang kerja kolom. Dan
00:31:56
teknik ini biasanya digunakan untuk
00:31:59
memurnikan
00:32:01
protein ya. Nah, pertama ya kita buat
00:32:04
kalibrasi kolom ya. Kita persiapkan
00:32:07
kolom dulu ya.
00:32:09
Myeimbangkan ee dengan buffer ya seperti
00:32:12
tadi ya. Buffer berjalan ya sehingga
00:32:17
gelembungnya tidak ada dihilangkan
00:32:19
gelembungnya atau diges kita perlu
00:32:21
diges. Fase gerak yang digunakan mungkin
00:32:23
contoh kita menggunakan buffer ya buffer
00:32:27
tris HCl ya. PH pH 7 ya biasanya ini
00:32:33
butuh beberapa jam ya butuh ee 3
00:32:37
jam, 24 jam atau ee 72 jam ya sambil
00:32:41
kita menyiapkan standar protein ini ya.
00:32:44
Ini protein ini kita siapkan ya. Di sini
00:32:48
ada feritin, ada konal bumin, oval buin,
00:32:52
karno big e
00:32:55
anhidridase, ribonuklease, apronitin ya.
00:32:59
Jadi campurkan semua standar ini dan
00:33:01
tambahkan hingga mencapai volumenya
00:33:05
1.000 ya 1000 mikron ya. Biasanya kalau
00:33:09
dihitung dari ini kita perlu menambahkan
00:33:13
295 mikrol buffer ya. Sterilkan ya.
00:33:18
sterilkan ya campuran ini dan biasanya
00:33:22
kita lakukan
00:33:23
sentrifugasi ya agar partikelnya
00:33:26
agregatnya mengedap ya untuk mendapatkan
00:33:29
supernatannya yang kita bisa injeksikan
00:33:32
ya jadi yang kita injeksikan adalah
00:33:35
supernatannya ya kalau ada agregat yang
00:33:37
mengendap kita tidak butuhkan hasilnya
00:33:40
seperti apa ya akhirnya seperti
00:33:43
ini. Terlihat di sini ada void ya, di
00:33:47
void volume berarti kalau di sini kita
00:33:50
menambahkan suatu komponen
00:33:53
teman-teman ya. Di sini void saya ulang
00:33:56
lagi adalah volume di mana suatu senyawa
00:34:00
yang tidak bisa masuk ke dalam pori-pori
00:34:03
partikel di dalam kolom. Jadi langsung
00:34:07
keluar. Dengan kata lain, volume di mana
00:34:11
senyawa berat molekul melebihi batas
00:34:14
atas rentang kerja
00:34:16
kolom. Ya, jadi void ini merupakan batas
00:34:21
atasnya. Ini tetap pasti ya. Semua
00:34:25
molekul yang terlalu besar ya tidak akan
00:34:28
masuk ke dalam kolom dan keluar
00:34:30
bersamaan dengan volume ini ya. tidak
00:34:34
peduli ukuran atau berat molekul
00:34:36
pastinya. Ini ee masuk akal karena
00:34:38
volume itu tidak dapat
00:34:40
dipisahkan ya. Mereka terlalu besar
00:34:43
untuk masuk
00:34:46
pori
00:34:48
ya. Untuk void ya ini keluar ya kita
00:34:52
bisa menggunakan ya paling umum adalah
00:34:55
blue dextrand yang di mana ukurannya
00:34:58
adalah 2000 kalton.
00:35:01
Blue Dexstran ini digunakan sebagai
00:35:04
marker ya. Blue Dexstran sebagai void
00:35:08
volume dalam
00:35:10
SEC. Jadi Bluxra disiapkan diinjeksikan
00:35:13
secara manual otomatis ya untuk
00:35:16
menentukan void
00:35:19
kolomnya ya. biasanya ini memvalidasi
00:35:22
performa dari kolom ya, terutama ketika
00:35:26
ee kolom tersebut lama tidak dipakai
00:35:29
atau setelah
00:35:31
dibersihkan ya. Lalu selanjutnya Anda
00:35:35
mungkin memperhatikan sumbu X di sini ya
00:35:38
terlihat sampai 120 mili ya. Ini adalah
00:35:42
angka total ya total volume ya yang
00:35:47
dapat diakses atau access aksesible.
00:35:50
volume dari kolom yang digunakan
00:35:52
accessible column total volume fase
00:35:57
diam ya. Jadi ee ini yang disebut volume
00:36:02
yang dapat diakses. Senyawa yang memilih
00:36:06
berat molekul yang sama ya atau ukuran
00:36:10
yang sama biasanya ya mereka ee atau
00:36:15
lebih kecil ya mereka bisa mengakses
00:36:18
sampai 100% dari volume
00:36:23
ini ya. sehingga itu mendefinisikan pada
00:36:27
di sini 120 itu adalah batas bawah
00:36:31
rentang kerja
00:36:34
kolom
00:36:36
ya. Kabar baiknya ya biasanya kalian
00:36:40
tidak perlu menentukan void volumen-nya
00:36:42
itu biasanya berapa karena akan
00:36:44
tercantum pada dokumen dari kolom ya.
00:36:48
Kalau di sini ya, siapa yang tertinggi
00:36:50
tadi ya? Fernnitin ya. Lalu disambung
00:36:54
dengan bonalbumin, oval bumin, karbonik
00:36:58
adhidrase,
00:37:00
ribonuklase ya, dan terakhir
00:37:07
apronitin. Ya, di sini saya menjelaskan
00:37:10
lagi ada dua void volume ya. Jadi volume
00:37:14
di mana sangat besar ee molekul sangat
00:37:17
besar ya tanpa masuk dalam ee pori sama
00:37:20
sekali biasanya sepertiga teman-teman
00:37:23
dan ee terletak di awal ya di awal
00:37:27
kromatogram atau puncak pertama.
00:37:29
Biasanya kalau kalian melaksukkan buat
00:37:31
strun ini akan keluar pertama kali
00:37:33
sehingga untuk batas atas accessible
00:37:37
volume adalah volume maksimal yang dapat
00:37:39
diakses ya sekitar seluruh volume jadi
00:37:43
120 mili ini menentukan batas
00:37:47
bawahnya ya dan di akhir
00:37:52
kromatogram ya oke kita lakukan
00:37:55
perhitungan KD salah satu contoh kita
00:37:58
lihat Lihat void volumenya ya di sini
00:38:04
48,2a kita contoh fernitin veritid ya
00:38:09
terlihat ya hitung KD langkanya
00:38:11
bagaimana ini untuk membuat suatu kurva
00:38:14
kalibrasi atau kurva bakunya ya hitung
00:38:19
KD untuk setiap standar protein dulu ya
00:38:23
hitung KD-nya berapa? Jadi di sini ya,
00:38:26
KD void-nya adalah
00:38:28
48,2. Accessible volume-nya adalah 120
00:38:32
ya. Feritin dia keluar di
00:38:35
59,6 jadi 59,6 -
00:38:38
48,2 per120
00:38:42
-48,2 kita lihat akan dapat 0,159.
00:38:46
Sedangkan di sini ada 44 kilo
00:38:50
Dalton ya. Di sini akan dapat
00:38:54
dia. Jadi lock loog dari sini ini saya
00:38:57
lakukan ini screenshot dari
00:39:00
kalkulator ya. Log adalah
00:39:03
5,64 ya 5
00:39:08
788 ya. Lalu diapain ya? Kita akan
00:39:11
tentukan di sini ya. 5 koma berapa itu
00:39:14
di sini
00:39:17
dengan ya
00:39:20
0,159
00:39:22
KD-nya. Nah, di sini ya ada bilang KD,
00:39:26
ada yang bilang
00:39:28
KAV. Nah, di sini dihitung satu persatu
00:39:32
dan didapatkan suatu persamaan sumbu y =
00:39:37
a + bx ya.
00:39:40
sedikit berbanding terbalik. Jadi
00:39:42
menurun ya, Teman-teman. Bukan
00:39:45
naik, bukan naik tapi
00:39:49
menurun. Lalu kalau kita punya sampel ya
00:39:52
kita tentukan tadi satu persatu. Lalu
00:39:55
kita punya sampel itu bagaimana? Kita
00:39:57
injeksikan sampelnya. Yaah, dalam
00:39:59
kondisi yang sama ternyata VR-nya dapat
00:40:03
94,3. Jadi, kita akan nentukan berapa
00:40:07
sih ini ukurannya.
00:40:09
ya 94,3
00:40:12
-4,82 ya
00:40:14
per10 -48,2 dapatnya
00:40:18
0,6419 ya di sini kita masukkan ke dalam
00:40:22
persamaan yang di atas sehingga ketika
00:40:26
log kita harus tentukan 10
00:40:29
pangkatnya ya nanti kita akan latihan di
00:40:32
kelas ya ketemu 19,6
00:40:36
kilo Dalton.
00:40:39
ya. Nanti kita akan lakukan banyak
00:40:42
diskusi ini di dalam ee pertemuan tatap
00:40:47
muka ya. Dari sini kita akan bisa
00:40:50
menentukan berapa ukuran
00:40:54
partikelnya ya. Ini yang hal menarik.
00:40:57
Ukuran fisik ya tadi k ukuran fisik
00:41:01
berat molekul dan pemisahan dalam SEC.
00:41:03
Ukuran sampel dan berat molekul itu
00:41:06
tidak selalu sama dan tidak selalu
00:41:08
berbanding lurus, Teman-teman. Ya,
00:41:11
biasanya molekul ada yang lebih ringan
00:41:13
bisa jadi lebih besar.
00:41:16
Ukurannya lebih besar dibandingkan
00:41:18
molekul yang lebih berat. Ya, jadi tidak
00:41:22
serta-merta kita bisa hubungkan. Kalau
00:41:25
ukuran fisiknya besar, ukurannya besar
00:41:28
itu selalu berat molekulnya besar. belum
00:41:30
tentu ya. Bisa jadi seperti ee serat ya
00:41:34
atau batang
00:41:36
ya. Itu kayak ee polisakarida itu lebih
00:41:40
mungkin dia tidak berat tapi ukurannya
00:41:45
besar. Jadi SEC itu berdasarkan ukuran
00:41:50
secara harafiah bukan berat. Tapi dalam
00:41:54
praktiknya ya tadi saya bilang ada
00:41:56
beberapa detektor yang digebungkan
00:41:59
dikombinasikan salah satunya adalah LED
00:42:01
scattering based detection atau muls ya
00:42:05
multiangel multiangel light scattering
00:42:08
yang dikombinasikan dengan refractive
00:42:11
index. Ini adalah kombinasi yang menjadi
00:42:14
kode standar ya untuk menentukan ukuran
00:42:18
dan berat molekulnya ya. J nilai
00:42:21
scatering mengukur ukuran dan berat
00:42:23
molekul secara rata-rata berdasarkan
00:42:25
interaksi cahaya dengan partikel ber
00:42:28
molekul dalam larutan. Ya. Jadi tolong
00:42:32
dibedakan. Jadi untuk SEC biasanya saya
00:42:35
dihubungkan dengan berat molekul belum
00:42:37
tentu ee sama teman-teman. Ada yang
00:42:40
ukurannya besar tapi berat molekulnya
00:42:43
ringan.
00:42:44
Jadi SEC biasanya sangat dikombinasikan
00:42:48
ya. Kombinasi yang sangat golden
00:42:49
standard yaitu yang tadi MS dengan RI
00:42:52
dengan
00:42:53
SEC ya. Untuk diskusinya lebih lanjut
00:42:57
kita akan diskusi tatap muka ya pada
00:43:00
pertemuan berikutnya. Jadi tolong untuk
00:43:02
lihat ini dulu, video ini dulu untuk
00:43:06
mendalami teorinya sehingga dalam tatap
00:43:08
muka pertemuan berikutnya kita akan
00:43:11
lebih intens ya. Sekian dulu pertemuan
00:43:15
kita. Kita akan lanjut ke pertemuan
00:43:17
tatap muka dan sampai jumpa di pertemuan
00:43:20
tatap muka selanjutnya.
