Hva er molekylær kloning?

Molekylær kloning er en prosess der et spesifikt DNA-fragment isoleres og overføres til en plasmidvektor.

Hva består en typisk plasmidvektor av?

En typisk plasmidvektor har en replikasjonsopprinnelse, et seleksjonsmarkørgen (som gir antibiotikaresistens) og et multiklonsæt som kan kløyves av restriksjonsenzymer.

Hvordan forberedes DNA-fragmentet og plasmidvektoren for kloning?

De behandles med restriksjonsenzymer som kløyver DNA-molekylene og produserer overhengende enkeltstrengede nukleotidhaler.

Hva er rollen til DNA-ligase i molekylær kloning?

DNA-ligase er enzymet som fusjonerer de komplimentære endene av vektor- og innsatt DNA til ett intakt DNA-molekyl.

Hva er transformasjon i sammenheng med molekylær kloning?

Transformasjon er prosessen der ligasjonsblandingen introduseres inni E. coli-cellene, og deretter selekteres celler med plasmider ved hjelp av antibiotika.

Hva skjer med klonene etter transformasjonen?

De selekterte klonene vokser videre i et flytende medium, og DNAet blir deretter ekstrahert fra dem for videre analyser.

Hvordan sikres ekspresjonen av innført gen i en vertscelle?

Vectormultiplikasjonsted kan omgis av promotor- og terminatorkoder som styrer ekspresjonen av innsatte gener.

Hvorfor brukes E. coli i molekylær kloning?

E. coli brukes fordi det er en velstudert organisme der plasmidvektoren enkelt kan amplifiseres og manipuleres.

Hva er formålet med en seleksjonsmarkør i en plasmidvektor?

Seleksjonsmarkøren, som et antibiotikaresistensgen, hjelper med å identifisere celler som har tatt opp plasmidvektoren.

Hva er multiklonsätta i en plasmidvektor?

Multiklonsättet er et område i plasmidvektoren som kan kløyves med forskjellige restriksjonsenzymer for å få plass til innført DNA.

Key Steps of Molecular Cloning

00:07:20

https://www.youtube.com/watch?v=sjwNtQYLKeU

Summary

TLDRMolekylær kloning er en teknikk hvor et spesifikt DNA-fragment isoleres og settes inn i en plasmidvektor, slik at det kan amplifiseres og studeres i detalj. En plasmidvektor er en sirkulær DNA-struktur som lett kan replikeres i E. coli og manipuleres i laboratoriet. Prosessen begynner med behandling av både DNA-fragment og plasmidvektor med restriksjonsenzymer, som cleaver DNAet for å skape overhengende ender som kan sammenføyes med DNA-ligase. Deretter introduseres denne DNA-blandingen i E. coli gjennom transformasjonsprosessen. Celler som har tatt opp plasmidene velges ved hjelp av antibiotikaresistens, noe som resulterer i kolonidannelse. Disse klonene dyrkes videre, og DNAet ekstraheres for videre bruk i forskningen. Teknikken tillater enkel amplifikasjon og langvarig lagring av DNA, samt mulighet for funksjonelle studier av gener.

Takeaways

🔬 Molekylær kloning isolerer og overfører spesifikke DNA-fragmenter til plasmidvektorer.
🧬 Plasmidvektorer inneholder replikasjonsopprinnelse, seleksjonsmarkører og multiklonsätter.
🔗 DNA-ligase sammenføyer vektor og innsatt DNA til et intakt molekyl.
🌡️ Transformasjon involverer temperaturendringer for å introdusere DNA i E. coli.
🧫 Antibiotika selekterer celler som har tatt opp plasmider under transformasjon.
📈 Amplifikasjon av DNA i E. coli muliggjør dypere genetiske studier.
🧪 Restriksjonsenzymer gir overhengende ender for kloning.
🗂️ Lagret DNA kan brukes for langvarige funksjonelle studier.
⚗️ E. coli er en foretrukket vert på grunn av enkel manipulasjon av plasmider.
🔍 Multiklonsät muliggjør multippel kløyving med restriksjonsenzymer.

Timeline

00:00:00 - 00:07:20
Molekylær kloning er prosessen med isolering av et spesifikt DNA-fragment og overføring av dette fragmentet til en plasmid-vektor. Etter å ha blitt en del av plasmid-vektoren, kan DNA-fragmentet lett amplifiseres, sekvenseres, lagres over lang tid, og brukes til genuttrykk og andre funksjonelle studier. To startingredienser for molekylær kloning er en plasmid-vektor og et DNA-fragment som skal settes inn i det. Fragmentet er ofte et gen eller en annen funksjonell region fra en levende celle, men kan også være en kunstig sekvens med egenskaper nyttige for forskeren. Plasmid-vektoren er et sirkulært stykke DNA som enkelt kan amplifiseres i E. coli, lagres lenge, og manipuleres enkelt i et prøverør.

Mind Map

Faqs

Hva er molekylær kloning?
Molekylær kloning er en prosess der et spesifikt DNA-fragment isoleres og overføres til en plasmidvektor.
Hva består en typisk plasmidvektor av?
En typisk plasmidvektor har en replikasjonsopprinnelse, et seleksjonsmarkørgen (som gir antibiotikaresistens) og et multiklonsæt som kan kløyves av restriksjonsenzymer.
Hvordan forberedes DNA-fragmentet og plasmidvektoren for kloning?
De behandles med restriksjonsenzymer som kløyver DNA-molekylene og produserer overhengende enkeltstrengede nukleotidhaler.
Hva er rollen til DNA-ligase i molekylær kloning?
DNA-ligase er enzymet som fusjonerer de komplimentære endene av vektor- og innsatt DNA til ett intakt DNA-molekyl.
Hva er transformasjon i sammenheng med molekylær kloning?
Transformasjon er prosessen der ligasjonsblandingen introduseres inni E. coli-cellene, og deretter selekteres celler med plasmider ved hjelp av antibiotika.
Hva skjer med klonene etter transformasjonen?
De selekterte klonene vokser videre i et flytende medium, og DNAet blir deretter ekstrahert fra dem for videre analyser.
Hvordan sikres ekspresjonen av innført gen i en vertscelle?
Vectormultiplikasjonsted kan omgis av promotor- og terminatorkoder som styrer ekspresjonen av innsatte gener.
Hvorfor brukes E. coli i molekylær kloning?
E. coli brukes fordi det er en velstudert organisme der plasmidvektoren enkelt kan amplifiseres og manipuleres.
Hva er formålet med en seleksjonsmarkør i en plasmidvektor?
Seleksjonsmarkøren, som et antibiotikaresistensgen, hjelper med å identifisere celler som har tatt opp plasmidvektoren.
Hva er multiklonsätta i en plasmidvektor?
Multiklonsättet er et område i plasmidvektoren som kan kløyves med forskjellige restriksjonsenzymer for å få plass til innført DNA.

View more video summaries

Get instant access to free YouTube video summaries powered by AI!

Subtitles

Auto Scroll:

00:00:01
Molecular cloning is a process of isolation of a specific DNA fragment and transfer of
00:00:05
this fragment into a plasmid vector.
00:00:13
As a part of the plasmid vector, the DNA fragment could be easily amplified, sequenced, stored
00:00:18
for long periods of time, and used for gene expression and other functional studies.
00:00:36
Two starting ingredients of molecular cloning are a plasmid vector and a DNA fragment that
00:00:41
has to be inserted in it.
00:00:43
The DNA fragment is usually a gene or other functional region from a living cell, or it
00:00:47
could be an artificial sequence with properties useful for a researcher.
00:00:59
Plasmid vector is circular piece of DNA that could be easily amplified in E. coli, stored
00:01:04
for long periods of time, and easily manipulated in a test tube.
00:01:08
A typical plasmid vector contains:
00:01:11
- an origin of replication that allows it to be replicated inside a bacterial cell;
00:01:16
- a selection marker, for example a beta lactamase gene coding for ampicillin resistance;
00:01:20
- and a multiple cloning site , which could be cleaved with several restriction enzymes,
00:01:25
such as BamHI (G-GATCC), EcoRI (G-AATTC) or NcoI (C-CATGG).
00:01:29
In many vectors, the multiple cloning site is surrounded by sequences of promoter and
00:01:33
terminator, that guide expression of inserted genes after the vector is introduced inside
00:01:38
a cell.
00:01:41
To be used for molecular cloning, both vector and insert DNA are treated with restriction
00:01:46
enzymes that cleave double stranded DNA molecules producing overhanging single stranded nucleotide
00:01:52
tails.
00:03:05
After their ends have been prepared with restriction enzymes, vector and insert are combined together,
00:03:10
and another enzyme, called a DNA ligase is added to
00:03:24
the mix.
00:03:27
At the same time as complimentary base pairing of single stranded overhands brings the ends
00:04:22
of vector and insert together, the DNA ligase fuses them into one intact DNA molecule.
00:04:37
In order to make multiple copies of this molecule, the ligation mixture is introduced inside
00:04:42
the E. coli cells in a process called transformation.
00:05:05
During the transformation the cell-DNA mixture is kept on ice and then exposed to 42 oC.
00:05:11
Such sudden change in temperature drives the DNA inside some of the E. coli cells.
00:05:16
Then the cells are plated on a plate with growth medium supplemented with a selective
00:05:20
antibiotic.
00:05:22
Only the cells that acquired the plasmid have resistance to the antibiotic and are capable
00:05:26
of growth on such a medium.
00:05:28
After overnight incubation at 37 oC each transformed cell produces a colony of identical cells,
00:05:34
oftentimes called a clone.
00:05:40
The selected clones are then individually picked, grown even further in a liquid medium,
00:05:49
and the DNA is extracted from them.
00:06:09
Thus, in the process of molecular cloning, a DNA fragment that represented a tiny fraction
00:06:50
of cell genome is integrated into a bacterial plasmid.
00:06:53
As a part of a plasmid, this DNA fragment represents a quarter or more of total DNA
00:06:58
in a test tube and it could be effortlessly and endlessly amplified in E. coli.